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Nanoporos: secuenciación rápida del Coronavirus como alternativa a la PCR

La pandemia de COVID-19 ha sacado a la luz que necesitamos protocolos analíticos innovadores y rápidos, que puedan ser implementados en primera línea de actuación en hospitales



Nanoporos: secuenciación rápida del Coronavirus como alternativa a la PCR

    Entre todas las tecnologías de secuenciación existentes, la secuenciación por nanoporos destaca por su rapidez, flexibilidad y bajo coste de inversión. Se realiza con un instrumento portátil que cabe en la palma de la mano y permite la secuenciación completa de virus en menos de 8 horas.

    Gracias a estas características, la secuenciación por nanoporos ha ganado protagonismo en los últimos años. Ha sido empleada en la investigación de los mayores brotes epidémicos internacionales, como los de ébola y el zika. Y está jugando un papel fundamental en la detección del coronavirus SARS-CoV-2 responsable de la COVID-19.


La primera pandemia global de la era genómica

    La actual pandemia, que azota al mundo entero, es la primera gran epidemia de dimensión global surgida en la era genómica. En el siglo XXI, la revolución de las tecnologías de secuenciación de ADN nos permite una mejor caracterización de los organismos causantes de enfermedades, y los microorganismos en general. Esta información es esencial para saber cómo cambian los organismos patógenos, se adaptan, se transmiten y dispersan las enfermedades por el mundo.

    Los cambios en el genoma se denominan mutaciones y, en el caso concreto del SARS-CoV-2, estos cambios son esenciales para rastrear el virus y realizar un seguimiento de los contagios. Sin olvidar su interés a la hora de desarrollar tratamientos y vacunas.

    A nivel global existen iniciativas internacionales como GISAID y NextStrain que han permitido trazar un mapa de seguimiento de la transmisión del virus por países y fechas en función de sus mutaciones. Uniendo esta información a coordenadas geoespaciales y temporales permite conocer las rutas de dispersión que ha seguido la expansión del coronavirus por todo el planeta.


Cómo secuenciar un virus ARN con tecnología de nanoporos

    La tecnología de nanoporos fue propuesta en 1996 por David Deamer y Daniel Branton. La empresa Oxford Nanopore Technologies ONT la desarrolló a nivel comercial por primera vez en 2014. Consiste en hacer pasar una de las hebras del ADN a través del poro de una proteína sintética con un diámetro interior de 1 nanómetro. Esta proteína está colocada en una membrana de polímero resistente a la electricidad. Cuando el ADN pasa a través del poro se crea una alteración característica en la corriente eléctrica que permite identificar la secuencia de nucleótidos.

    La secuenciación de ADN por nanoporos alcanza una exactitud superior al 99,99% en secuencias consenso, a pesar de tener una tasa de error superior a otras plataformas de secuenciación más establecidas.


    El SARS-CoV-2 es un coronavirus con un genoma de aproximadamente 30.000 ribonucleótidos de longitud (ARN). Las principales diferencias entre el ARN y el ADN son:

    .- el ARN está formado por una cadena simple, mientras que el ADN está formado por una cadena doble;

    .- las bases nitrogenadas del ADN son Adenina, Timina, Guanina y Citosina, mientras que en el ARN, la Timina está sustituida por Uracilo.

    Tradicionalmente, para secuenciar el ARN se necesita un paso previo: convertirlo a su ADN complementario, usando la enzima llamada transcriptasa inversa. Esto se realiza mediante la técnica RT-PCR, que genera una gran cantidad de este ADN complementario a partir de cada hebra de ARN. Una vez convertido el ARN en ADN, este se puede secuenciar con cualquier plataforma de secuenciación.

    Una característica única en la tecnología de secuenciación por nanoporos es la posibilidad de secuenciar el ARN directamente. Esto permite prescindir del paso de conversión a ADN, acelerando así el proceso de diagnostico del virus en las muestras. Además, la secuenciación por nanoporos no tiene límite de tamaño en los fragmentos secuenciados - a diferencia de otras tecnologías, lo que permite secuenciar el ARN viral completo en un solo fragmento y detectar las modificaciones (metilaciones) en las bases del ARN viral.

    Entre todas las tecnologías de secuenciación existentes, la secuenciación por nanoporos es única por su rapidez, ya que permite la secuenciación completa de virus en tiempo real. Actualmente el tiempo necesario desde la muestra clínica a la secuencia del coronavirus es de 8 horas.


Detección de SARS-CoV-2 mediante nanoporos

    La presencia del coronavirus en un paciente se realiza mediante la detección de su material genético. La necesidad de secuenciar el SARS-CoV-2 de manera rápida, ya sea para realizar diagnóstico o seguimiento de las mutaciones del virus, ha lanzado a muchos grupos de investigación a desarrollar estrategias de secuenciación del genoma completo del virus.

    El protocolo más popular actualmente es, sin duda, el desarrollado por ARTIC-Network, que amplifica el ARN del virus usando más de 200 fragmentos. Recientemente se han propuesto modificaciones a este protocolo con un menor número de fragmentos de mayor tamaño, lo que simplifica la secuenciación del genoma viral. Algunas de estas estrategias podrían incluso reducir el tiempo de secuenciación a 4 horas.

    La detección del virus por secuenciación con nanoporos es tan fiable como el método estándar de RT-PCR. La secuencia del genoma completo permite identificar mutaciones específicas del virus, que es una información imprescindible para el seguimiento de la pandemia a nivel global (epidemiología genómica).
 

Cómo lo están usando en la COVID-19

    Algunos países han adoptado la secuenciación por nanoporos como técnica certificada para el diagnostico de la enfermedad y el seguimiento de la pandemia. Sin ir más lejos, en el Reino Unido y en Estados Unidos se han creado redes de centros de salud pública y universidades para la secuenciación del genoma del SARS-CoV-2, donde los laboratorios utilizan tanto secuenciación por nanoporos como por síntesis. Esto permite un seguimiento de las mutaciones que han ido ocurriendo en el genoma, y trazar la propagación del virus.

    En Nueva York (Estados Unidos), la empresa Clear Labs ha invertido 18 millones de dolares en el desarrollo de un sistema de diagnóstico con esta tecnología, que permitirá diferenciar entre pacientes infectados con SARS-CoV-2 y otros patógenos que producen síntomas similares.

    En España aún no está muy implantada esta tecnología en el diagnóstico, pero varios grupos, incluido el de los autores del artículo, están optimizando el protocolo rápido con nanopore pensando en su futura aplicación en rutina clínica.

    La gran ventaja de la tecnología de nanoporos es que permite secuenciar el virus en tiempo real en un mayor número de contagiados, aumentando la disponibilidad de información a la vez que optimiza tiempo e inversión. Y lo que es aún más importante, se realiza con un instrumento portátil que cabe en la palma de una mano y es fácil de utilizar e implementar en los hospitales para establecer un sistema de vigilancia de COVID-19 donde más se necesita.


Óscar González-Recio
Investigador especializado en mejora genética animal
Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA)

Carlos Flores Infante
director del grupo de Investigación “Variación genética y enfermedad” del Hospital Universitario Nuestra Señora de Candelaria y director de la División de Genómica del Instituto Tecnológico y de Energías Renovables
Hospital Universitario Nuestra Señora de Candelaria

Jaime Martinez-Urtaza
Departamento de Genética y Microbiología
Universitat Autònoma de Barcelona

Olga Francino Martí
investigadora del Servicio Veterinario de Genética Molecular - SVGM (Dept. de Ciencia Animal y de los Alimentos)
Universitat Autònoma de Barcelona

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